مقدمه

 Polymerase Chain Reaction)PCR) تکنیکی است که به طور گسترده ای در بیولوژی مولکولی به کار برده می شود. این تکنیک نام خود را از یکی از ترکیبات کلیدی خود، DNA پلیمراز ، که جهت تهیه تعداد بسیار زیادی از کپی از یک رشته DNA مورد نظر بکار گرفته می شود؛ می گیرد. با ادامه روند PCR از تعداد کپی های اولیه یک قطعه DNA، که ممکن است یک یا تعداد بسیار کمی باشند، به عنوان الگو استفاده شده و به میزان بسیار زیادی در حد چندین میلیون کپی تولید می گردد. که محصول نهایی PCR را به طور کلی آمپلیکون (Amplicon) گویند. که به معنی ماده تقویت شده یا آمپلی فاید شده است.

تقریبا تمام DNA پلیمراز مقاوم به حرارت را جهت انجام پلیمریزاسیون به کار می گیرند که یکی از مهمترین آنها آنزیم Taq DNA Polymerase که  از باکتری Thermus aquaticusکه در چشمه های آبگرم جوشان زندگی می کنند بدست می آید. این آنزیم نوکلئوتیدهای مختلف را مطابق با تریب الگوی DNA اولیه در کنار هم قرار می دهد تا رشته جدید بوجود آید. البته همانطور که می دانید جهت آغاز فعالیت هر DNA پلیمراز نیاز به یک رشته اولیه و آغاز گر بخصوصی است که در ابتدا طراحی کرده و در لوله آزمایشی که قرار است این واکنشها صورت بگیرد رار داده می شوند که به این عمل طراحی پرایمر گفته می شود. اکثریت روشهای PCR از چرخه های حرارتی (Thermal Cycling) استفاده می کنند که شامل درجه حرارتهای مختلفی است که در هر چرخه تکرار جهت انجام اعمال خاصی که در ادامه اشاره خواهد شد؛ می شوند که بطور کلی هر چرخه کامل حرارتی را که زمانهای مشخصی نیز دارند را یک سیکل گویند ( Cycle) گویند. بطور معمول هر عمل PCR به حدود 40-20 سیکل نیاز دارد. بطور کلی این چرخه ها جهت جدا شدن دورشته DNA از همدیگر، اتصال  پلیمراز و انجام عمل آن و ... است. اختصاصیت عمل PCR به پرایمر بستگی دارد.  

تاریخچه:

این تکنیک در سال 1984 توسط کاری مولیس (Kary Mullis) معرفی شده و بطور سریعی در اکثر آزمایشگاههای جهان جهت اهداف مختلف بکار گرفته می شود. که برخی از آنها عبارتند از: کلونینگ DNA برای تعیین توالی (Sequencing)، فیلوژنی بر پایه DNA، بررسیهای عملکردی ژنها، تشخیص های ارثی ، شناسایی و انگشت نگاری ژنتیکی و ردیابی و تشخیص بیماریهای عفونی. در سال 1993 مولیس بخاطر ابداع این روش، جایزه نوبل را دریافت نمود.

اساس و روش کار PCR

PCR جهت تقویت ناحیه و یا قطعه خاصی از DNA (DNAهدف) بکار گرفته می شود. که می تواند یک ژن واحد، قسمتی از ژن یا توالی غیر کد کننده باشد. اکثر روشهای PCR بطور تیپیک قطعاتی با اندازه حدود 10Kbp را تقویت می کنند ولی در برخی روشها تا Kbp40 نیز قابل انجام است، با توجه به اینکه افزایش طول DNA خطر شکستن آن را در حین حملو نقل یا انجام آزمایش افزایش می دهد، افزایش طول قطعه DNA نیاز به رعایت و انجام اعمال اضافی دارد.

یک سیستم PCR بطور اولیه شامل چندین ترکیب و مواد دارد که عبارتند از:

1-   DNA الگو که قصد تقویت آن است.

2-   دوقطعه پرایمر که به دوسر 3’ یا 5’ متصل می گردد که این اتصال وابسته به نوع پرایمر و پلیمراز است که به سر 3’ متصل شود یا 5’

3-   Taq پلیمراز یا هر پلیمراز دیگری که درجه حرارت اپتیمم فعالیت آن در حدود 70 درجه باشد.

4-   دزوکسی نوکلئوتیدهای سه فسفاته (dNTP) که اجزاء سازنده DNA هستند.

5-   محلول بافر که محیط مناسبی را جهت فعالیت و پایداری پلیمراز و خود DNA فراهم می آورد.

6-  کاتیونهای دو ظرفیتی مانند Mg++، Mn++ ، بطور معمول از Mg++ استفاده می شود زیرا افزایش میزان Mn++ با افزایش میزان موتاسیون در نتیجه ایجاد خطا در قرار دادن نوکلئوتیدها توسط پلیمراز، همراه بوده است.

کل عمل PCR در میکروتیوبهای 200-10 میکرولیتری صورت می پذیرد. دستگاههایی را که عمل ایجاد سیکلهای حرارتی را انجام می دهند و در واقع نقش اصلی آن ایجاد سیکلهای حرارتی با زمانهای مشخص قابل برنامه ریز و تعداد مشخص را دارند را ترمال سایکلر (Thermal Cycler) گویند. اکثر این دستگاههای نوین از اثر پلتیر (Peltier Effect) جهت سرد و گرم کردن متوالی میکروتیوبها ، استفاده می کنند. این روش با استفاده از صفحات بخصوصی صورت می گرد که با تغییر جهت جریان سرد یا گرم می شوند.

نحوه عمل PCR

همانطور که گفته شد هر PCR شامل 40-20 چرخه حرارتی است که سیکل معروفند. این چرخه ها نیز بطور معمول دارای 3-2 درجه حرارت مشخص است. که معمولا از سیکل های حرارتی سه مرحله ای استفاده می کنند(شکل...). البته ممکن است این سیکلها با یک درجه حراتی که معمولا بالای 90 درجه است جهت آماده سازی و یا در آخر عمل جهت استخراج محصولات نیز همراه باشد که که به آن Hold گویند. درجه حرارتهایی که استفاده می شوند و مدت زمانهایی که رعایت می گردند به عوامل متعددی از قبیل نوع آنزیم مورد استفاده، غلظت یونهای دوظرفیتی و دزوکسی نوکلئوتیدها و درجه حرارت ذوب شدن پرایمرها بستگی دارد.

بطور کلی مراحل PCR با توجه به شکل به صورت زیر است:

1-  مرحله آغاز (Initialization step): این مرحله شامل گرم کردن مواد به درمای حدود 96-94 (یا 98 درجه زمانی که از پلیمراز فوق العاده مقاوم به حرارت استفاده می شود) است که معمولا 9-1 دقیقه بطول می انجامد. البته اینه مرحله در مواردی بکار می رود که پلیمراز مورد استفاده جهت انجام فعالیت نیازبه گرم شدن دارد که به Hot- start PCR معروف است.

2-  مرحله دناتوراسیون( Denaturation Step): این مرحله اولین مرحله معمول PCR  بوده و شامل گرم کردن محیط به میزان 98-94 درجه به مدت 30-20 ثانیه است. این عمل باعث ذوب شدن DNA (جدا شدن دو رشته DNA از همدیگر) هم DNA الگو و هم DNA پرایمر از طریق از بین رفتن باندهای هیدروژنی بین نوکلئوتیدهای دورشته DNA و تولید DNAتک رشته ای است.

3-  مرحله اتصال (Annealing step): در این مرحله درمای واکنش به 65-50 درجه به مدت 40-20 ثانیه کاهش می یابد تا امکان اتصال DNA پلیمراز و پرایمر به DNAالگو که حالا تک رشته ای است فراهم آورد. بطور تیپیک درجه حرارت اتصل حدود 5-3 درجه کمتر درجه حرارت ذوب شدن پرایمر انتخاب می شود. مناسب ترین اتصال DNA-DNA بین رشته الگو و پرایمر زمانی ایجاد می گردد که هر دورشته در فاصله نزدیکی از هم قرار گیرند و هرچه توالی پرایمر با توالی رشته الگوی متناسب تر باشد این اتصال قوی تر بوده و اتصال قوی جهت انجام عمل پلیمراز مورد نیاز است.

4-   مرحله گسترش یا طویل شدن (Extension/Elongation step): درجه حرارت این مرحله به آنزیم پلیمراز مورد استفاده و درجه حرارت اپتیمم مورد نیاز برای آن بستگی دارد. بطور مثال آنزیم Taqپلیمراز در درجه حرارت 80-75 درجه سانتیگراد فعالیت قابل قبول داشته  ولی بطور معمول از درجه حرارت 72 درجه سانتیگراد برای این آنزیم استفاده می شود. در این مرحله پلیمراز نوکلئوتیدهای مکمل را بر اساس رشته الگو از 5’-3’ در کنار هم قرار داده و در نهایت رشته مکمل رشته الگوی اولیه را تولید می کند.  مدت زمان این مرحله به پلیمراز و طول رشته DNA الگو بستگی دارد. به عنوان یک قانون در درجه حرارت اپتیمم پلیمراز بایستی 1000 نوکلئوتید در دقیقه را پلیمریزه نماید. در شرایط مساعد برای مثال اگر محدودیت سوبسترا وجود نداشته باشد در هر مرحله گسترش DNA دوبرابر می شود.

5-  طویل شدن نهایی( Final Elongation): این مرحله فقط یکبار و پس از آخرین سیکل PCR و در دمای 74-70 درجه بمدت 15-5 دقیقه صورت میگیرد جهت اطمینان از تبدیل کلیه DNAهای تک رشته ای به دورشته ای انجام می گیرد.

6-   مرحله نهایی (Final Hold): این مرحله در 15-4 درجه سانتیگراد جهت نگه داری کوتاه مدت محصولات واکنش تا زمان استخراج انجام می گیرد.

جهت اطمینان از اینکه محصول PCR همان توالی مد نظر بوده از الکتروفورز برروی ژل استفاده می شود. در این روش جهت مشخص کردن قطعه DNA با وزن مولکولی مشخص و مورد نظر از DNA Ladder استفاده می شود و قطعه مورد نظر در الکتروفورز از روی اندازه مولکولی استاندارد و کنترل مثبت مشخص می گردد.

کاربرد های مهم PCR

جداسازی DNA ژنومی

تقویت و بررسیهای کمّی DNA

در تشخیص بیماریها

که شامل بررسی بیماریهای بدخیم و سرطانها و بیماریهای عفونی است.

انواع تکنیکهای PCR

این تکنیکها از طریق ایجاد تغییرات مختصری در تکنیک PCR اولیه برای مثال ایجاد تغییرات در نحوه بکارگیری پرایمرها و... ایجاد و ابداع شده و جهت اهداف خاصی برنامه ریزی و اختصاصی شده اند.

این روشها شامل:

1-      Allele-specific PCR

2-      Assembly PCR یا PCA (Polymerase Cycling Assembly)

3-      PCR نامتقارن (Asymetric PCR)

4-      Helicase- Dependent amplification

5-      Hot-start PCR

6-      Inter sequence  specific PCR (ISSR)

7-      Inverse PCR

8-      Ligation-mediated PCR

9-      Methylation- specific PCR (MSP)

10-  MiniPrimer PCR

11-  Multiplex Ligation- dependent Probe Amplification (MLPA)

12-  Multiplex PCR

13-  Nasted PCR

14-  Overlap Extension PCR

15-  Quantitative PCR (Q-PCR)

16-  Reverse Transcription PCR

17-  Solid Phase PCR

18-  Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL PCR)

19-  Touch Down PCR

20-  PAN-AC

21-  Universal Fast Walking